Laboratorijsko ispitivanje poremećaja koagulacije

Literatura za rešavanje testa

Reč autora

 

 

Poštovani polaznici kursa,

U toku izlaganja trudili smo se da predstavimo sve novine i tehnike vezane za laboratorijsko ispitivanje poremećaja koagulacije.

 

Test se sastoji od 50 pitanja koja se zasnivaju na prezentovanom materijalu.

 

 

 

ŽELIMO VAM PUNO USPEHA U REŠAVANjU TESTA! 


dr Zoran Stanojković

lekar  

Zavod za transfuziju krvi Niš

Medicinski fakultet Niš

 dr sci. med. Ana Antić

lekar    

 Zavod za transfuziju krvi Niš

Hemostaza

 

Hemostaza je jedan od najznačajnijih sistema za održavanje homeostaze ljudskog organizma i ima značajnu ulogu u održavanju tečnog stanja krvi u cirkulaciji i zaustavljanju krvarenja posle povrede krvnog suda. Postoji stalna ravnoteža činilaca koji podstiču aktivaciju hemostaze i činilaca koji inhibiraju i kontrolišu hemostazu:

Slika 1. "Tromboza je hemostaza na pogrešnoj strani", Mc Farlan

 

Pojačana inhibicija hemostaze može da dovede do krvarenja, kao što i aktivacije hemostaze može da dovede do pojave tromboze unutar krvnog suda.

Slika 2. Normalna hemostaza – “održavanje u centru”

preuzeto sa: www.medscape.org, article 571999

 

 

Nakon završene punkcije toštane srži na isto mesto se radi i biopsija ukoliko je potrebno. Biopsija se radi posebnom iglom za biopsiju koštane srži slika 2.

Hemostaza je kompleksan sistem koji ima četiri faze, a to su:

1.       Vaskularna faza,

2.       Trombocitna faza,

3.       Koagulaciona faza,

4.       Fibrinoliza.

Slika 3. Shematski prikaz hemostaze

 

 

Uloga krvnog suda u hemostazi – VASKULARNA FAZA

 

Hemostaza se aktivira povredom krvnog suda pri čemu dolazi do vazokonstrikcije, zbog refleksnog grča mišića krvnog suda i delovanja vazokonstriktivnih supstanci: angiotenzina II koji se sintetiše u endotelu i tromboksana A2 (TxA2) koji se sintetiše u trombocitima. Takođe, iz Weibl-Paladijevih telašaca endotelnih ćelija stvara se von Willebrand-ov faktor (vWF) koji ima izuzetno značajnu ulogu u adheziji i agregaciji trombocita (vWF se vezuje za kolagen i još neke komponentne subendotela, a trombociti se preko GpIb vezuju za vWF).

 

Uloga trombocita u hemostazi – TROMBOCITNA FAZA

 

Prvi korak u formiranju primarnog (trombocitnog) tromba je adhezija trombocita na subendotel povređenog zida krvnog suda.  Adhezija trombocita se odigrava vezivanjem adhezivnih proteina iz matriksa, kao što su kolagen i fibronektin, za specifične glikoproteinske (GP) receptore (integrine) na membrani trombocita. Najvažniji receptori su: trombinski, kolageni (GP Ia/IIa-GP VI), adhezioni (GP Ib/V/IX-vWF, GP IIb/IIIa-fibrinogen), adrenergički, purinergički, serotoninski, TxA2. vWF pravi most između krvnog suda i trombocita, tako što se na jednom kraju molekula vezuje za subendotelni kolagen, a na drugom kraju za GP Ib/IX na membrane trombocita.

 

Slika 4. Trombocitna faza hemostaze

 

 

Agregacija trombocita se odvija pod dejstvom agonista, kao što su ADP, epinefrin, trombin ili kolagen. Epinefrin i ADP su slabi agonisti trombocitne agregacije i da bi ostvarili svoju funkciju pražnjenja sadržaja iz trombocitnih granula zahtevaju prisustvo prostaglandina (PG) i TxA2. Za razliku od toga, prostaciklin je snažan inhibitor trombocitne agregacije.

Slika 5. Formiranje trombocitnog tromba

preuzeto sa: www.medicinejournal.wordpress.com

 

 

Za vreme adhezije i aktivacije trombociti gube svoj diskoidni oblik i postaju sferični sa dugačkim pseudopodama (slika 6).

Slika 6. Elektronska mikroskopija – promena izgleda trombocita nakon aktivacije

 

 

 

Na adherirane trombocite lepe se slobodni cirkulišući trombociti, međusobno agregiraju, stvarajući primarni (trombocitni) ugrušak, koji zatvara defekt zida krvnog suda. Delovanje agonista dovodi do oslobađanja sadržaja trombocitnih granula, pa se iz gustih granula oslobađaju kalcijum, serotonin i ADP, koji potpomažu dalje agregaciju, dok se iz α-granula oslobađaju trombocitni faktor 4 (TrF4), β-tromboglobulin, trombospondin, trombocitni faktor rasta, fibrinogen i IgG.

Slika 7. Agregacija trombocita, preuzeto sa: www.medscape.org

 

 

KOAGULACIONA FAZA

 

Koagulacija krvi je serija enzimskih procesa u kojima neaktivni faktori koagulacije postaju aktivni, a ovi aktiviraju sledeći u seriji (kaskadni sitem) – slika 8. Primarno mesto sinteze svih faktora koagulacije je jetra, osim FVIII, koji se sintetiše u endotelnim ćelijama hepatičnih sinusoida, mononuklearnim ćelijama bubrega, slezine i alveolarnim makrofagama.

Koagulacija se odvija putem spoljašnjeg, unutrašnjeg i zajedničkog puta. Unutrašnji put aktivira FXI, FIX, FVIII, TrF3 i kalcijum koji aktiviraju FX. Spoljašnji put obuhvata tkivni tromboplastin koji se oslobađa povredom tkiva i utiče na aktivaciju FVII. Zajednički put započinje aktivacijom FX.

Slika 8. Kaskadni sistem koagulacije

 

Prema celularnom modelu, koagulacija ima tri faze, a to su inicijacija, amplifikacija i propagacija. Početna faza (inicijacija) podrazumeva povezivanje tkivnog faktora (TF) sa FVIIa i aktivaciju FX i FIX (slika 9). Aktivirani FX aktivira FV na površini ćelije noseći TF i taj kompleks pretvara malu količinu protrombina u trombin. U drugoj fazi amplifikacije stvoreni trombin dovodi do aktivacije trombocita, FV, FVIII, FXI i FXIII (slika 10). U završnoj fazi propagacije aktivirani FIXa i FVIIIa stvaraju kompleks koji snažno aktivira FX. Aktivirani FXa zajedno sa FVa stvara kompleks protrombinaze koji pretvara značajnu količinu protrombina u trombin (slika 11). Stvoreni trombin pretvara fibrinogen u rastvorljiv fibrin koji pod uticajem FXIIIa postaje nerastvorljiv koagulum. Aktivirani FXIa aktivira FIX i omogućava dalje formiranje trombina koji je potreban za aktivaciju trombin aktivirajućeg inhibitora fibrinolize (TAFI) koji sprečava ranu fibrinolizu. To znači da nedostatak FXI ne ugrožava koagulaciju već inhibira fibrinolizu.

   

Slika 9. Faza inicijacije                                                   Slika 10. Faza amplifikacije                                                   Slika 11. Faza propagacije

  

 

Sistem koagulacije ima i preciznu i neophodnu kontrolu u inhibiciji koagulacije odnosno ograničavanju procesa koagulacije na mestu povrede krvnog suda. Najznačajniji inhibitori koagulacije su: antitrombin III (AT III), trombomodulin, TFPI, protein C, protein S, heparin kofaktor 2, C1-esteraza inhibitor, α2-makroglobulin i α2-antiplazmin.

 

FIBRINOLIZA

 

Fibrinoliza obezbeđuje rekanalizaciju krvnog suda i zadržavanje ugruška na mestu povrede krvnog suda. Ravnoteža u sistemu fibrinolize, kao i ravnoteža između sistema fibrinolize i sistema koagulacije obezbeđuje tečno stanje krvi u cirkulaciji, te ako se poremeti ta ravnoteža može doći do intravaskularnog zgrušavanja krvi tj. do pojave tromboze.

Faktori fibrinolize su plazminogen, plazmin, aktivatori plazminogena (tkivni tip (t-PA) i urokinaza tip (u-PA)), inhibitori aktivatora (PAI-1 i PAI-2) i antiplazmini (α2-antiplazmin, C1-inhibitor, α2-makroglobulin).

Glavni enzim fibrinolize je plazmin, koji se u cirkulaciji nalazi u neaktivnom obliku (plazminogen), koji se sintetiše u jetri. Delovanjem aktivatora plazminogen prelazi u plazmin. Glavni supstrat za delovanje plazmina je fibrin, međutim istovremeno on razgrađuje fibrinogen, FV, FVII i vwF, a aktivira prekalikrein, HMWK i elemente komplementa.

Slika 12. Sistem fibrinolize, preuzeto sa: www.studyblue.com

 

Hemostaza kod novorođenčadi

 

Koagulaconi i fibrinolitički faktori ne prolaze placentranu barijeru, već se nezavisno stvaraju u fetusu počev od 10-11. gestacijske nedelje i vrednosti većine koagulacijskih proteina rastu proporcionalno sa gestacijom. Međutim, postoje fiziološke razlike između pojedinih faktora koagulacije, pa FVIII, FV, vWF i fibrinogen dostižu normalne vrednosti (kao kod odraslih osoba) već u 30. nedelji gestacije, dok vitamin K zavisni faktori (FII, FVII, FIX, FX i protein C) dostižu tek 40-60% normalnih vrednosti na rođenju. Normalne vrednosti faktora i inhibitora koagulacije dostižu se do šestog meseca života, osim proteina C koji normalne vrednosti dostiže tek u ranom detinjstvu. Važno je napomenuti da je kod majke na porođaju snižen FXI, kao i da je D-dimer, iako test niske specifičnosti za dijagnozu tromboze, u trudnoći uvek fiziološki povišen.

 

  

Hemoragijski sindromi – KOAGULOPATIJE

Koagulopatije predstavljaju poremećaje koagulacije krvi i najčešće su posledica nedostatka jednog faktora koagulacije koji može biti urođen ili stečen, što je mnogo češće, usled poremećaja organa koji učestvuju u stvaranju faktora koagulacije. Koagulopatije mogu biti posledica potpunog deficita ili smanjene sinteze određenog faktora koagulacije, stvaranja izmenjenih formi faktora, njihove povećane razgradnje, usled prisustva inhibitora ili intravaskularne koagulacije (DIK).

Najčešći uzrok naslednih poremećaja koagulacije je smanjena sinteza ili smanjena funkcionalna aktivnost jednog plazmatskog faktora koagulacije, retko dva ili više. Ove bolesti su retke i zahtevaju timski rad lekara različitih specijalnosti, pre svega hematologa, pedijatra, transfuziologa, ortopeda, fizijatra i stomatologa. Najčešće urođene koagulopatije su: hemofilija A (deficit FVIII), hemofilija B (deficit FIX) i von Willebrandova bolest (deficit von Willebrand-ovog faktora (vWF)), znatno ređe se javljaju deficit FVII, FV i FX, kao i afibrinogenemija.

Stečene koagulopatije su česte i uglavnom nastaju kao posledica poremećaja više faktora koagulacije. Najčešće se javljaju se u sklopu oboljenja jetre i bubrega, kao i kod hipovitaminoze K (zbog smanjene sinteze vitamin K zavisnih faktora koagulacije – FII; FVII, FIX i FX, i inhibitora – proteina C i proteina S). Takođe se javljaju u sklopu masivne transfuzije, usled dilucionog efekta konzervisane krvi u kojoj postoji deficit FV, FVIII i smanjen broj funkcionalnih trombocita, kao i u sklopu diseminovane intravaskularne koagulopatije (DIK) kod koje se u isto vreme javljaju tromboza i  krvarenje.

Koagulopatije se klinički manifestuju pojavom krvarenja različitih lokalizacija, a najčešće u zglobovima i mišićima (hemartroze, hematomi) – slika 13. Krvarenje može biti odloženo posle trauma, traje dugo, ne može se zaustaviti lokalnom kompresijom i često se ponavlja.

Slika 13. Klinička slika koagulopatija

 

Dijagnoza koagulopatija

 

Dijagnoza koagulopatija se postavlja na osnovu anamneze, kliničkog preleda i laboratorijskog ispitivanja.

U sklopu anamneze treba prikupiti podatke o tome da li postoji sklonost ka krvarenju (lokalizacija, vreme pojave prvog krvarenja, dužina trajanja, učestalost), da li je ta sklonost zajednička za članove porodice, da li je prilkom vađenja zuba ili hirurške intervencije bilo krvarenja, da li bolesnik boluje od nekih drugih bolesti, i dr.

Fizičkim pregledom dobijaju se podaci o prisustvu i tipu krvarenja, prisustvu i lokalizaciji petehija i hematoma, deformaciji zglobova, splenomegaliji i prisustvu palpabilnih kolekcija u mišićima.

Laboratorijsko ispitivanje poremećaja koagulacije omogućava precizno određivanje vrste i stepena poremećaja. Osnovni uslov za adekvatno laboratorijsko ispitivanje je da uzorak krvi bude uzet i obrađen na propisani način.

 

Uzimanje i obrada uzorka krvi za laboratorijsko ispitivanje koagulopatija

 

Uzorak krvi se dobija punkcijom vena kubitalne regije. Venepunkcija treba da bude izvedena uz minimalno oštećenje tkiva, da bi se izbegla aktivacija trombocita, sistema koagulacije i fibrinolize. Krv se uzima u vakuum epruvete sa 3,8% rastvorom natrijum citrata, kao antikoagulansom (slika 14).

Odnos krvi i antikoagulansa treba da bude 9:1 (9 ml krvi na 1 ml antikoagulansa).

Slika 14. Primer vakutajner epruvete za laboratorijsko ispitivanje poremećaja koagulacije

 

Za ispitivanje hemostaze koristi se plazma, koja se dobija centrifugiranjem uzorka u što kraćem roku po uzimanju krvi. Analize treba uraditi odmah ili najdalje do četiri sata od uzimanja uzorka. Ukoliko to nije moguče plazmu treba zamrznuti i čuvati na niskoj temperature najduže nekoliko meseci (nije dozvoljeno odmrzavanje i ponovno zamrzavanje plazme). Hemolizirane i lipemične uzorke ne treba uzimati u rad.

 

SKRINING KOAGULACIJSKI TESTOVI

 

U laboratorijskoj dijagnostici poremećaja koagulacije prvo se izvode skrining (orijentacijski) testovi, i na osnovu tih rezultata procenjuje potreba za izvođenjem dodatnih specifičnih testova. Skrining testovi su jednostavni, lako dostupni, ne zahtevaju skupu opremu i reagense, tako da mogu da se izvode u većini laboratorija. Rezultati se dobijaju brzo (≈ 1h), što doprinosi orijentaciji u hitnim stanjima i adekvatnom izboru terapije. U dijagnostici koagulopatija danas se koriste sledeći skrining testovi: protrombinsko vreme (PT), aktivisano parcijalno tromboplastinsko vreme (aPTT) i trombinsko vreme (TT). Ovi testovi obuhvataju poremećaje u stvaranju unutrašnjeg puta aktivisanja koagulacije (aPTT), spoljašnjeg (PT) i zajedničkog puta (TT) koagulacije, bilo da se radi o pojedinačnim defektima ili o udruženim poremećajima više faktora koagulacije. Uz navedene testove preporučuje se i određivanje koncentracije fibrinogena, vreme krvarenja i broj trombocita.

Protrombinsko vreme (PT) je test kojim se meri aktivnost faktora protrombinskog kompleksa (FII, FVII, FIX, FX) i fibrinogena u plazmi. Određuje se dodavanjem tkivnog tromboplastina i kalcijuma plazmi usled čega dolazi do aktiviranja FVII i FX, dok se u prisustvu FV i FII protrombin pretvara u trombin, a fibrinogen u fibrin.

Slika 15. Određivanje protrombinskog vremena

 

 

Dakle, kroz PT se zaobilaze faktori koji učestvuju u unutrašnjem putu koagulacije, odnosno  određuju spoljašnji i zajednički put koagulacije:

Slika 16. Elementi hemostaze koji se određuju kroz protrombinsko vreme (PT),

preuzeto sa www.practical-haemostasis.com

 

Normalne vrednosti PT-a su 11-13 sekundi (70-100%). PT je produženo u deficitima faktora FII, FV, FVII, FX, fibrinogena, kao i u prisustvu inhibitora fibrinogen-fibrin reakcije (heparin i FDP), u oboljenjima jetre, hipovitaminozi K, kod pacijenata koji su na oralnoj antikoagulantnoj terapiji (OAT), u DIK-u. PT se takođe koristi za kontrolu OAT-a, ali se u cilju standardizacije rezultati ne izražavaju u procentima, već u INR sistemu, gde je INR=PRISI, a PR (prothrombin ratio) se dobija kad se PT bolesnika podeli sa PT normalne plazme. Normalna vrednost INR-a je 1,0 (kod osoba koje nisu na OAT-u, PT=70-100%), dok su terapijske granice INR-a (u zavisnosti od dijagnoze osnovnog oboljenja) od 2,0 do 3,5.

Aktivisano parcijalno tromboplastinsko vreme (aPTT) je test kojim se meri aktivnost aktivnost svih faktora koagulacije osim FVII i FXIII. Određuje se tako što se plazmi najpre doda kaolin koji aktivira FXII i FXI, a zatim fosfolipid, da bi se u prisustvu kalcijuma aktivirali ostali faktori unutrašnjeg puta koagulacije (FVIII, FIX, FX, FXI i FV).

Slika 17. Određivanje aPTT-a

Slika 18. Elementi hemostaze koji se određuju kroz aPTT – unutrašnji i zajednički put koagulacije

preuzeto sa:  www.practical-haemostasis.com

 

Normalne vrednosti aPTT-a zavise od vrste reagenasa, a za većinu iznosi 25-35 sekundi. Produženo aPTT se sreće kod poremećaja svih plazmatskih faktora koagulacije osim FVII i FXIII, a naročito u hemofilijama. Takođe je produženo kod DIK-a, u oboljenjima jetre, u sindromu masivnih transfuzija, kod prisustva stečenih inhibitora koagulacije, u terapiji heparinom ili kontaminacijom uzoraka krvi heparinom. aPTT se koristi za laboratorijsko praćenje terapije heparinom, tako što se uzorak krvi pacijenta kod intermitentnog davanja heparina uzima na sredini intervala između dve doze, a najkasnije jedan sat pre sledeće doze. Kod pacijenata koji su na kontinuiranoj terapiji heparinom uzorak krvi za određivanje aPTT-a se mora uzeti iz druge ruke. Terapijske granice aPTT-a su 1,5 do 2,5 puta duže od svedoka. Terapija niskomolekularnim heparinom koji se danas najčešće koristi za postizanje antikoagulantnog efekta se ne prati kroz aPTT, već određivanjem anti-Xa četiri sata posle davanja doze heparina.

Trombinsko vreme (TT) meri vreme pretvaranja fibrinogena u fibrin pod uticajem trombina, gde se svi ostali faktori zaobilaze, tako da predstavlja zajednički put koagulacije.

Slika 19. Elementi hemostaze koji se određuju kroz trombinsko vreme (TT),

preuzeto sa www.practical-haemostasis.com

 

Test se izvodi tako što se citratnoj plazmi bez trombocita dodaje trombin, koji pretvara fibrinogen u fibrin, a zatim se meri brzina nastanka koaguluma. Normalna vrednost je 16-20 sekundi. TT je produženo u hipo- i afibrinogenemijama (DIK, primarna fibrinoliza, urođena hipofibrinogenemija), u prisustvu inhibitora pretvaranja fibrinogena u fibrin, kao što su heparin i FDP. TT se koristi u kontroli trombolitičke terapije (treba da bude produženo 2-4 puta).

Fibrinogen ima značajnu ulogu u izvođenju skrining koagulacijskih testova, kao što su PT i aPTT. Određivanje koncentracije fibrinogena standarnom metodom po Clauss-u podrazumeva dodavanje trombina plazmi, pri čemu se meri vreme koagulacije koje je proporcionalno koncentraciji fibrinogena. Normalna koncentracija fibrinogena iznosi 2-4 g/L, patološke vrednosti se javljaju u sklopu hipo- ili disfibrinogenemije.

Vreme krvarenja je skrining test za procenu primarne hemostaze tj. uloge krvnih sudova, trombocita, von Willebrandovog faktora i fibrinogena. Ovim testom se meri sposobnost zaustavljanja krvarenja posle povrede malih krvnih sudova. Metodom po Duke-u se lancetom napravi ubod dubine 2,5mm u centralni deo jagodice uha, a kapi krvi se upijaju filter-papirom bez dodirivanja mesta uboda.

Krvarenje se normalno zaustavlja za 1-3 min. Metoda po Ivy-u podrazumeva da se manžetna aparata za merenje krvnog pritiska postavi na nadlakticu i naduva na 40 mmHg. Lancetom se napravi plitak rez (dubina ≈ 1mm, dužina 10 mm) na donjoj strani podlaktice. Meri se vreme od trenutka incizije do potpunog zaustavljanja krvarenja, a na svakih 30 sekundi se filter papirom upijaju kapi krvi.

Krvarenje se normalno zaustavlja za manje od 9,5 minuta. Vreme krvarenja je produženo kod postojanja vaskulopatija, kod smanjenog broja trombocita, ako je poremećena adhezija i/ili agregacija trombocita, ako je poremećena reakcija oslobađanja trombocita (ADP ili TxA2), ako je smanjen TF3, kod von Willebrand-ovog oboljenja i kod hipofibrinogenemija.

Broj trombocita se danas najčešće određuje automatski, mnogo ređe manuelno, iz venske ili kapilarne krvi. Normalan broj trombocita je 150 – 450 x 109/L.

Skrining testovi kod naslednih koagulopatija prikazani su u tabeli 1, dok su koagulacijska ispitivanja kod pacijenata sa pridruženim drugim oboljenjima (stečene koagulopatije) prikazana u tabeli 2.

 

Tabela 1. Skrining testovi u naslednim koagulopatijama

 

Tabela 2. Skrining testovi kod stečenih koagulopatija

 

 

Specifični koagulacijski testovi

Kada rezultat skrining testova ukazuje na poremećaj hemostaze izvode se specijalni testovi, kao što su: određivanje aktivnosti pojedinačnih faktora koagulacije i koncentracije antigena, određivanje funkcije trombocita, određivanje prisustva inhibitora faktora koagulacije, određivanje vWF, testovi za kontrolu poremećaja fibrinolize, dijagnoza von Willebrand-ove bolesti, dijagnoza DIK-a.

                Određivanje pojedinih faktora koagulacije je posebno značajno u dijagnozi i diferencijalnoj dijagnozi naslednih koagulopatija, koje su najčešće uslovljene poremećajem jednog faktora koagulacije, i to najčešće deficitom FVIII u hemofiliji A i FIX u hemofiliji B. Osim toga, važno je odrediti i stepen poremećaja, kako u hemofiliji, tako i kod postojanja deficita FV, FX, FII i fibrinogena. Određivanje koncentracije faktora FII, FV, FVII i FX je test baziran na određivanju PT-a (normalne vrednosti su 0,7-1,5 IU/dl), dok se određivanje FVIII, FIX, FXI i FXII bazira na aPTT-u (normalne vrednosti 0,5-1,5 IU/dl). Osnovne karakteristike faktora koagulacije i preporuke za korekciju deficita pojedinih faktora prikazane su u tabeli 3.

Tabela 3.  Osnovne karakteristike faktora koagualcije i preporuke za supstituciju radi korekcije deficita

 

Vreme euglobulinske lize je test kojim se određuje fibrinoliza. Izvodi se mešanjem citratne plazme osiromašene trombocitima sa kiselinom, što dovodi do taloženja određenih faktora koagulacije u kompleks koji se naziva euglobulinska frakcija (FVIII, fibrinogen, PAI-1, plazminogen, t-PA, α2-antiplazmin). Nakon precipitacije euglobulinska frakcija se resuspenduje u boratnom rastvoru, a koagulacija se aktivira dodavanjem kalcijum hlorida na 37°C. Naknadna fibrinoliza se ranije određivala posmatranjem ugruška golim okom na svakih 10 minuta sve do kompletne lize ugruška, dok se danas uglavnom koriste automatski aparati bazirani na principu spektrofotometrije. Normalno vreme euglobulinske lize je duže od 2 sata, a patološke vrednosti se sreću kod primarne patološke fibrinolize i u sklopu DIK-a.

Kod sumnje na ubrzanu fibrinolizu moguće je odrediti i koncentraciju plazminogena, koja je u tom slučaju najčešće smanjena (normalne vrednosti su 75-130 %). Danas su dostupni i testovi za određivanje t-PA i PAI-1.