LABORATORIJSKO PRAĆENJE PRIMENE ANTITROMBOCITNIH LEKOVA

Literatura za rešavanje teста

Reč autora

 

 

Poštovani polaznici kursa,

U toku izlaganja trudili smo se da predstavimo laboratorijsko praćenje primene antitrombocitnih lekova.

 

Test se sastoji od 50 pitanja koja se zasnivaju na prezentovanom materijalu.

 

ŽELIMO VAM PUNO USPEHA U REŠAVANјU TESTA!

  dr sci. med.

Ana Antić

 

  Prim dr sci.med.

Zoran Stanojković

 

 Zavod za transfuziju krvi Niš


Uvod

 

Mnogostruka uloga trombocita u nastanku arterijske tromboze ukazuje na poseban značaj i vrednost primene antitrombocitnih lekova u prevenciji i lečenju tromboza u arterijskom vaskularnom prostoru. Ipak, kao i ostale terapijske strategije, ona ne može da obezbedi preveciju svih kardiovaskularnih dogadjaja, što je i opravdano imajući u vidu kompleksnost razvoja arterijske tromboze i specifičnosti fiziologije trombocita. Upravo taj nedostatak terapijskog uspeha primene antitrombocitnih lekova je nametnuo potrebu uvođenja brojnih dijagnostičkih testova sa ciljem adekvatnog vođenja i optimizacije antitrombocitne terapije.

Agregacija trombocita, kao laboratorijski test za procenu funkcije trombocita je izuzetno efikasna metoda za optimalno vođenje antitrombocitne terapije i izdvajanje pacijenata kod kojih postoji suboptimalni odgovor na antitrombocitne lekove, kao što su aspirin i klopidogrel. Ovaj suboptimalni odgovor je definisan kao rezistencija trombocita i povezan je sa nepovoljnim ishodom terapije. Termin trombocitne rezistencije se ne sme olako upotrebljavati, jer može imati štetan efekat ako se ne protumači ispravno. Pogrešno identifikovan, može proizvesti povećani rizik tromboze, ako se terapija pogrešno prekine, ili povećani rizik hemoragije, ako se doza antitrombocitnog leka pogrešno poveća.

Definicija aspirinske rezistencije je u literaturi vrlo raznovrsna i opisuje se kao neuspeh u prevenciji trombotičnog događaja, nesposobnost aspirina da inhibiše stvaranja tromboksana (TxA2) ili da izazove produženje vremena krvarenja. Takođe, izostanak svakog efekta in vivo testiranja aktivnosti trombocita može se definisati kao aspirinska rezistencija, a razlozi njenog nastanka nalaze se u individualnom oporavku trombocita nakon primene aspirina, trombocitnoj hiperreaktivnosti, molekularnim genetskim varijantama COX-1 i interreakciji drugih lekova sa COX-1 inhibitorima. Rezistencija na klopidogrel je posledica varijabilnosti trombocitnog odgovora na ADP, genetske varijabilnosti (polimorfizam enzima jetre koji su uključeni u metabolizam klopidogrela ili u okviru P2Y12 trombocitnog receptora) ili intereakcije sa lekovima (npr. inhibitori protonske pumpe). Podaci u savremenoj literaturi o prevalenci rezistencije na antitrombocitne lekove su prilično nekonzistentni i variraju od 5 % do 80 %, zavisno od primenjene dijagnostičke metode. Iako je taj raspon širok, postoje uverljivi dokazi da je rezistencija na antitrombocitne lekove klinički visoko značajna, jer je udružena sa kardiovaskularnim, cerebrovaskularnim ili perifernim arterijskim oboljenjima.

Danas je dostupan veliki broj komercijanih testova za praćenje efekta aspirina i klopidogrela čija primena omogućava izdvajanje pacijenata koji su u suštinskom riziku za neželjene događaje dok su na antitrombocitnoj terapiji. Merenja putem klasične agregometrije zasnivaju se na promeni svetlosnog prenosa koju registruje fotometar (PFA-100 (Platelet Function Analyzer, Siemens)  a koja je posledica promene oblika i agregacije trombocita, dok se impedantna agregometrija (Multiplate (Multiplate Platelet Function Analyzer, Dynabyte, Germany) zasniva na promeni rezistencije koja je proporcionalna broju trombocita koji su adherirali na elektrode. Dosadašnja ispitivanja su pokazala da postoji korelacija između rezultata testiranja agregacije trombocita na aparatima PFA-100 i Multiplate analyzer, ali da se impedantna agregometrija potvrđuje kao superiorna metoda, obzirom na veću osetljivost i brzinu testiranja, kao i uključivanje u transfuzijske algoritme na kojima se bazira primena produkata krvi.

Dalje kliničke studije posebno treba usmeriti u pravcu određivanja stepena inhibicije agregacije trombocita, merenog primenom klasične i impedantne agregometrije, na kome je bezbedno izvoditi invazivne procedure, uključujući hirurške intervencije.

 

 

Tromboze arterijskih krvnih sudova

 

Najteže kardiovaskularne i cerebrovaskularne bolesti, ishemijski moždani udar i infarkt miokarda, koji su vodeći uzroci smrti u svetu, nastaju kao direktna posledica tromboze arterijskih krvnih sudova. Prema podacima o bolestima srca i moždanom udaru u Americi (Heart Disease and Stroke Statistics) uzročnik su 34,30 % smrtnog ishoda u 2010. godini, na trećem mestu po redosledu kod žena, a na četvrtom kod muškaraca. Potpuni prekid protoka krvi u koronarnom, moždanom ili drugom perifernom krvnom sudu jeste završni događaj složenog procesa oštećenja integriteta arterija velikog i srednjeg promera koji se odvija kontinuirano pod zajedničkim uticajam ateroskleroze i arterijske tromboze, koji su etiopatogenetski povezani.

Osnovni preduslov nastanka arterijske tromboze je poremećaj funkcije ili narušavanje integriteta endotela, što se sreće u okviru ateroskleroze. Sadržaj krupnog lipidnog jezgra ateroma, rascepljeni tanki fibrozni pokrivač, obilje vanćelijskog matriksa, prisutnost zapaljenskih ćelija i visok sadržaj tkivnog faktora (TF) izazivaju adheziju i aktivaciju trombocita, kao i aktivaciju koagulacionog sistema (slika 1).

7335

Slika 1a. Vazokonstrikcija na mestu oštećenja zida krvnog suda

7335

Slika 1b.  Primarna hemostaza – adhezija trombocita, oslobađanje sadržaja trombocitnih granula, agregacija trombocita

Trombociti adheriraju na mestu oštećenja kroz proces adhezije, preko serije glikoproteinskih receptora (GP) na površini trombocita i odgovarajućih adhezivnih proteina, uključujući:

GP VI-kolagen, GP kompleks Ib-V-IX-vWF, integrin α2bβ3-fibrinogen (slika 2).

nm0609-607-F1

Slika 2. Adhezija i aktivacija trombocita – promena oblika iz diskoidnog u sferični

 

Na taj način pokreću se signalni prenosni mehanizmi koji stimulišu izlazak kalcijuma iz tubularnog sistema trombocita i izazivaju promenu oblika trombocita i pražnjenje sadržaja njihovih granula. Adhezija i aktivacija trombocita i proces njihove agregacije, uz funkcionalno sadejstvo von Willebrand-ovog faktora (vWF) i fibrinogena, direktne su posledice prepoznavanja trombogenog područja u krvnom sudu od strane ovih ćelija (slika 3).

Slika 3. Aktivacija trombocita uz sadejstvo sa VWF i fibrinogenom

 

 

Budući da reaktivnost trombocita zavisi od brojnih adhezivnih međureakcija, većina glikoproteina membrane trombocita su receptori adhezivnih proteina (slika 4). Po svojoj strukturi oni uglavnom pripadaju integrinima, selektinima i glikoproteinima koji su bogati leucinom. Punu funkcionalnost receptora omogućava njihova udruženost sa dinamičnim lipidnim skupinama, sastavljenim iz sfingolipida i holesterola, koje slobodno plivaju unutar tečne frakcije ćelijske opne trombocita.

 

Slika 4. Oslobađanje sadržaja trombocitnih granula

 

Raspad ateromske ploče izaziva dalje aktivaciju koagulacionog sistema pod uticajem TF koji u kofaktorskoj poziciji vezuje FVII/FVIIa i tako uvećava katalitičku aktivnost FVIIa. Aktivacija TF, F VII, kompleksa tenaze i protrombinaze su posledica aktivacije membrane, što vodi sekundarnoj hemostazi (slika 5). Finalni ishod je fibrinski stabilni agregat trombocita koji zatvara oštećenje krvnog suda i prevenira ozbiljnija krvarenja.

 

7335

Slika 5. Sekundarna hemostaza

Antitrombocitni lekovi

 

Mnogostruka uloga trombocita u nastanku arterijske tromboze ukazuje na poseban značaj i vrednost primene antitrombocitnih lekova u prevenciji tromboza u arterijskom vaskularnom prostoru. Pre više od sto godina ser John Vane i Bengt Samuelson utvrdili su da acetil salicilna kiselina (aspirin) inhibiše funkciju trombocita, pa je ovaj lek sa punim naučnim opravdanjem zauzeo prvo i vodeće mesto u velikoj porodici antitrombocitnih lekova (slika 6).

Slika 6. Antitrombocitni lekovi

 

Antitrombocitni lekovi svoju funkciju ispoljavaju preko odgovarajućih trombocitnih receptora (slika 7).

Slika 7a i 7b. Delovanje antitrombocitnih lekova

Acetilsalicilna kiselina

 

Acetilsalicilna kiselina je 1899. god. uvedena u medicinu pod imenom aspirin kao pouzdano antipiretsko, antiimflamatorno i analgetičko sredstvo. Inaktiviše trajno ciklooksigenaznu aktivnost prostaglandin-H sintetaze-1 i -2, koji se označavaju kao COX1 i COX2. Ovi enzimi katalizuju pretvaranje arahidonske kiseline u prostaglandin H2 iz koga se u trombocitima stvara tromboksan A2 (TxA2), a u ćelijama vaskularnog endotela prostaciklin I2 (PgI2) – slika 8.

Slika 8. Mehanizam delovanja acetilsalicilne kiseline

 

Tx A2 je pokretač aktivacije i agregacije trombocita. Deluje preko trombocitnih receptora TP-alfa i TP-beta izazivajući promenu oblika trombocita, sekreciju njihovih granula i povećavanje intraćelijskog sadržava kalcijuma. TxA2 takođe ima snažno vazokonstriktorno dejstvo.

U dnevnoj dozi od 20 do 80 mg aspirin u potpunosti inhibira COX-1 enzim i tako onemogućava stvaranje TxA2 u trombocitima. Efekat aspirina na COX-1 je reverzibilan i traje koliko i život trombocita, zaviseći od produkcije novih trombocita koji će omogućiti oporavak cikolooksigenazne aktivnosti na približno 10% dnevno kod zdravih ljudi. Male doze aspirina su dovoljne da suprimiraju više od 95% sinteze tromboksana preko COX-1, a takva supresija dovodi do inhibicije agregacije trombocita. Veće doze aspirina mogu inhibirati COX-2 sintezu prostaciklina u endotelnim ćelijama, ali on zadržava sposobnost da se regeneriše produkcija prostaciklina nekoliko sati nakon uzimanja aspirina. Aspirin se primenjuje u dnevnoj dozi u rasponu od 50-300 mg, pri čemu najčešće korišćena dnevna doza u dugoročnom preventivnom režimu iznosu po pravilu 100 mg za 24 sata. Antiagregacijsko dejstvo aspirina nastupa unutar 48 sati. Treba imati u vidu da primena aspirina nosi rizik pojave ozbiljnih gastrointestinalnih krvarenja.

771Drugu značajnu grupu antitrombocitnih lekova čine klopidogrel i tiklodipin, koji po hemijskom sastavu pripadaju tienopiridinima, a međusobno se razlikuju samo u prisustvu jedne karboksimetilske grupe koja postoji u molekulu klopidogrela, a nema je u strukturi tiklodipina. Ireverzibilno se vezuju za ADP receptor P2Y12 inhibirajući agregaciju trombocita, smanjujući prenos impulsa i posledičnu aktivaciju GPIIb/IIIa receptora, kao i smanjujući efekat amplifikacije aktivacije trombocita oslobađanjem ADP-a, kao slabog agonista trombocita i drugog sadržaja iz gustih granula (slika 9). Klopidogrel se metaboliše u jetri kako bi se stvorili aktivni metaboliti, i to preko CYP3A4, jednog od citohrom P450 enzima, koji je odgovoran za metabolizam lekova. Klopidogrel prolazi kroz dva koraka oksidacije kako bi se stvorili aktivni metaboliti koji će se ireverzibilno vezati za trombocitni ADP receptor P2Y12( P2Y12 i P2Y1 su G-proteinski parni receptori prisutni na membarni trombocita, čijom zajedničkom aktivnošću nastaje potpuni aktivacijski i agregacijski odgovor na stimulaciju ADP-om). Samo mala količina klopidogrela se metaboliše u aktivnu formu leka, dok najveći deo podleže hidrolizi u inaktivni derivat karboksilne kiseline.

Slika 9. Mehanizam dejstva klopidogrela

 

Kao i aspirin, klopidogrel se uzima u jednoj dozi dnevno, a pošto izaziva ireverzibilni efekat do kraja životnog veka trombocita, oporavak zavisi od stepena prometa trombocita.Uz početnu dozu od 300 do 600 mg pun antitrombocitni efekat klopidogrel postiže već za 4 do 6 sati, a doza održavanja terapijskog efekta je obično 75 mg za 24 sata.

Tiklodipin se obično primenjuje dva puta dnevno u dozi od 250 mg. I pored značajnog antitrombocitnog efekta, njegovu upotrebu ograničava usporeno dostizanje punog terapijskog efekta koje traje i do 5 dana, kao i mogućnost pojave neutropenije, kao ozbiljne komplikacije uzimanja ovog leka.

Treću značajnu grupu antitrombocitnih lekova čine inhibitori integrinskog trombocitnog receptora GP IIbIIIa, kao što su abciximab, tirofiban i eptifibatid. Abciximab je fragment himerizovanog humano-mišjeg monoklonskog antitela protiv receptora GP IIbIIIa, koji efikasno blokira funkciju trombocita čak i posle 48 sati nakon prekida terapije. Inhibicija GP IIbIIIa onemogućava adheziju i agregaciju trombocita, prekida proces njihove aktivacije i sprečava vezivanje trombocita sa vWF i fibrinogenom, čime se najdirektnije onemogućava stvaranje tromba. Ovi lekovi se primenjuju isključivo intravenskim putem i poseduju određeni imunogeni potencijal. Danas su u toku završna klinička ispitivanja novih, oralnih inhibitora GP IIbIIIa, kao što su orbofiban i xemilofiban.

 

 

Indikacije za primenu antitrombocitnih lekova

 

Klinička indikacija

Lek

Komenatar

Primarna prevencija visokog rizika

  •  Diabetes mellitus
  •  Hipertenzija

Aspirin

Aspirin

Periferna vaskularna oboljenja

Aspirin/klopidogrel

Klopidogrel je alternativa aspirinu

Atrialna fibrilacija

Aspirin

Valvula

  •  operacija
  •  bolest

 

Aspirin

Aspirin

 

Zajedno sa warfarinom

Ishemijska bolest srca

  •  stablilna angina
  •  acutni koronarni sindrom

- Bez elevacije ST segmenta

       -sa PCI

       -bez PCI

-Elevacija ST segmenta kod akutnog infarkta miokarda

 

Aspirin/klopidogrel

Aspirin

Aspirin/klopidogrel

Aspirin

Aspirin/klopidogrel

 

Bolja efikasnost

Bolja efikasnost

Prethodni infarkt miokarda

Aspirin/klopidogrel

Klopidogrel je alternativa aspirinu

Elektivna PCI -ugradnja stenta

Aspirin

Aspirin/klopidogrel

Postkoronarni bypass

Aspirin

Akutni moždani udar/TIA

Aspirin

Prethodni moždani udar

Aspirin/klopidogrel

Klopidogrel je alternativa aspirinu

 Antitrombocitni lekovi mogu se primenivati pojedinačno ili kao kombinacija dva leka sa različitim mehanizmom delovanja. Brojne kliničke studije podržavaju bezbednost i efikasnost pojedinačne ili dvojne antitrombocitne terapije kod postojanja akutnog koronarnog sindroma (nestabilna angina, infarkt miokarda), ishemijskog moždanog udara, bolesti perifernih arterija, u primarnoj i sekundarnoj prevenciji kardiovaskularnih i cerebrovaskularnih bolesti, nakon perkutane koronarne intervencije, a napisani si u brojni vodiči u cilju promocije odluka o primeni antitrombocitne terapije u svakodnevnoj praksi.

 Tabela 1. pokazuje pregled indikacija za primenu aspirina i klopidogrea prema Američkoj Asocijaciji za Srce (AHA), Američkom Koledžu za Kardiologiju (ACC) i Evropskom Udruženju Kardiologa (ESC). To naravno nije definitivna lista, iako postoje opšte usvojena načela upotrebe ovih lekova.

Tabela 1. Indikacije za primenu antitrombocitnih lekova

Dodatni antitrombocitni lekovi mogu biti indikovani u specifičnim kliničkim stanjima i uvek je najvažnije proceniti korist prema riziku. U cilju izbegavanja neželjenih efekata, aspirin  treba da se primenjuje u najmanjoj individualnoj dozi koja pokazuje efikasnost.

Primena antitrombocitnih lekova ne isključuje mogućnost i potrebu istovremene primene i antikoagulantnih lekova, budući da su ključni događaji u nastanku tromboze, aktivacija trombocita i stvaranje trombina, i vremenski i prostorno isprepletani.

Kombinacija ove dve vrste lekova pruža pouzdaniju antitromboznu zaštitu, ali naravno podrazumeva i veći rizik od mogućeg krvarenja. Kod bolesnika sa ugrađenim mehaničkim srčanim zaliscima kombinovana antikoagulantna i antitrombocitna terapija predstvalja široko prihvaćeni princip dobre kliničke prakse.

Prema brojnim podacima iz literature (Bowry et al, Ben-Dor et al) klopidogrel u dozi od 75 mg i 300 mg aspirina su terapija izbora kod pacijenata sa akutnim koronarnim sindromom ili kod kojih se radi perkutana koronarna intervencija.

Kod pacijenata sa moždanim udarom kod kojih se ne primenjuje trombolitička terapija indikovana je primena aspirina u inicijalnoj dozi od 150 – 325 mg unutar 48h od početka moždanog udara.

U prevenciji moždanog udara kod pacijenata koji su već imali nekardioembolijski moždani udar ili tranzitorni ishemijski atak preporučuje se aspirin u dozi od 50 do 100 mg dnevno uz istovremenu primenu 75 mg klopidogrela.

 

Agregometrija

 

Agregaciju trombocita kao laboratorijski test za procenu funkcije trombocita uveo je Gustav VR Born 1962. godine i ona podrazumeva meru prozračnosti svetla u mutnoj plazmi bogatoj trombocitima (PRP). Nakon agregacije trombocita uzrokovane delovanjem agonista, zamućenost rastvora se smanjuje i više svetla prolazi kroz PRP, pri čemu se analiziraju ove promene i koreliraju sa promenom oblika trombocita, agregacijom ili dezagregacijom.

Slabi agonisti, kao što su epinefrin ili ADP u niskoj koncentraciji, pokazuju bifaznu krivulju agregacije, dok jaki agonisti, kao što su kolagen, trombin ili ADP u visokoj koncentraciji, izazivaju brz agregacioni odgovor. Na našim prostorima se za procenu funkcije trombocita koriste svetlosna i impedantna agregometrija.

Svetlosna agregometrija se zasniva na kontinuiranom povećanju obima svetlosne transmisije kroz suspenziju trombocita koja nastaje zbog njihove agregacije uzrokovane dodavanjem agonista. Ispitivanje se radi iz uzorka citratne krvi, a aparat koji se za tu svrhu najčešće upotrebljava je PFA-100 (Siemens). U specijalnim kivetama kroz kapilarnu cev se kreće krv sa antikoagulansom prema otvoru na membrani koja je obložena kolagenom i ADP-om (Col/ADP), ili koalgenom i epinefrinom (Col/EPI). Usled adhezije i agregacije trombocita postepeno se sužava otvor na membrani do konačnog zatvaranja (slika 10). Momenat zatvaranja i prekida daljeg protoka krvi registruje se i označava kao vreme zatvaranja.

Slika 10. Vreme zatvaranja (PFA-100, Siemens)

 

Očekivane normalne vrednosti vremena zatvaranja na aparatu PFA-100 su:

Kod pacijenata koji su na terapiji aspirinom ili inhibitorima GP IIbIIIa, korišćenjem Col/EPI vreme zatvaranja je produženo, čak i preko 300 sekundi, dok je Col/ADP normalno. Poremećaji funkcije trombocita koje je moguće utvrditi ispitivanjem funkcije trombocita svetlosnom agregometrijom prikazani su u tabeli 2.

Tabela 2. Poremećaji funkcije trombocita koji se utvrđuju ispitivanjem na PFA-100

 

Svetlosna agregometrija se ne pokazuje kao pouzdana metoda kod pacijenata koji imaju snižen hematokrit (< 0,28) ili smanjen broj trombocita (< 90 x 109/L). Pored toga, brojna ispitivanja su pokazala da ova metoda ne može da se koristi za praćenje terapije klopidogrelom, jer ne pokazuje osetljivost na ovaj lek. Iz tog razloga danas se za praćenje terapije klopidogrelom na aparatu PFA-100 koristi nova kiveta - Innovance PFA P2Y, kojom se postiže višestruko povećana osetljivost na antagoniste P2Y12 receptora u odnosu na klasičnu ADP indukovanu agregometriju, uz minimalnu osetljivost na preparate acetilsalicilne kiseline.

Impedantna agregometrija meri agregaciju trombocita nastalu usled ex vivo stimulacije trombcita upotrebom različitih agonista (ADP, arahidonska kiselina, TRAP-6, kolagen, ristocetin, PG E1). Ispitivanje se radi iz uzorka cele krvi pacijenta, a ispitivanje traje oko 6 minuta, zbog čega se ova metoda svrstava u „point-of-care“ testiranja. 

Najčešće korišćeni aparat je Multiplate Platelet Function Analyzer (Dynabyte, Germany). Multiplate test ćelije imaju dve nezavisne merne jedinice, od kojih je svaka sastavljena od dve bakarne, srebrom obložene elektrode. Procedura podrazumeva dodavanje heparinizirane krvi i fiziološkog rastvora u test ćeliju, nakon inkubacije na 37ºC dodaje se izabrani agonist, a dalje se uzorak krvi sa dodatim agonistom automatski meša korišćenjem magnetne mešalice obložene poli-tetra-fluoro-etilenom (PTFE). Aktivirani trombociti adheriraju na elektrode i pojačavaju električnu impedancu između njih koja se registruje u toku 6 minuta, a porast impedance se prevodi u proizvoljne agregacijske jedinice (arbitary aggregation units (AU)). Najvažniji parametri koji se prate u toku testiranja na Multiplate analyzer-u jesu (slika 11): površina ispod agregacijske krive (AUC), koja je direktno zavisna od visine krive, a pokazuje ukupnu aktivnost trombocita, visina agregacijske krive, koja pokazuje stepen agregacije trombocita i maksimalni nagib agregacijske krive, koji pokazuje brzinu agregacije trombocita.

Slika 11. Parametri Multiplate testiranja

U zavisnosti od vrste agonista koji se dodaje tokom testiranja Multiplate testovi su (slika 12):

  • ASPI test – aktivator: arahidonska kiselina, osetljiv na aspirin i antagoniste GP IIbIIIa, nije osetljiv na klopidogrel i vWF;
  • ADP test – aktivator: ADP, osetljiv na klopidogrel i antagoniste GP IIbIIIa, nije osetljiv na  aspirin i vWF;
  • ADP-HS test – aktivator: ADP + prostaglandin E1, osetljiv na klopidogrel i antagoniste GP IIbIIIa, nije osetljiv na  aspirin i vWF;
  • TRAP test – aktivator: TRAP-6 (aktivirajući peptid trombinskog receptora), osetljiv na antagoniste GP IIbIIIa, nije osetljiv na  aspirin, klopidogrel i vWF;
  • COL test – aktivator: kolagen, osetljiv na aspirin i antagoniste GP IIbIIIa, nije osetljiv na klopidogrel i vWF;
  • RISTO  test – aktivator: ristocetin, osetljiv na aspirin, kod Bernard-Soulier-ovog sindroma i u težim oblicima von Willebrandove bolesti (vWD), nije osetljiv u blažim oblicima vWD.

Slika 12. Osetljivost Multiplate testova na antitrombocitne lekove

 

Inhibicija agregacije trombocita postignuta primenom antitrombocitnih lekova značajno smanjuje parametre Multiplate testiranja (skraćuje rezultate tesova), i tako pokazuje postignutu efikasnost antitrombocitnih lekova.

Mogućnost dobijanja brze i reproducibilne procene funkcije trombocita pruža i aparat Verify Now (Accumetrics), koji takođe spada u grupu „point-of-care“ sistema. Procena inhibicije agregacije trombocita u ovom slučaju vrši se upotrebom specijalnih kiveta u kojima se praćenjem promena u obimu svetlosne transmisije meri stepen aglutinacije fibrinogenom obloženih zrnaca pod uticajem indukovane agregacije trombocita u celoj krvi, uzetoj sa antikoagulansom. Ovom metodom se uspešno procenjuje efekat GP IIbIIIa inhibitora, aspirina (Verify Now-ASA) i klopidogrela (Verify Now-P2Y12).

Određivanje vremena krvarenja podrazumeva procenu primarne hemostaze, te bi u tom smislu ova analiza takođe mogla da posluži za određivanje ukupne funkcije trombocita. U toku primene antitrombocitnih lekova vreme krvarenja je produženo, međutim ovaj test ima nisku osetljivost na prepoznavanje lekovima izazvanih poremećaja funkcije trombocita, veliki je broj činilaca koji utiču na rezultate testiranja (broj trombocita i eritrocita, aktivnost faktora koagulacije, osobina kože ispitanika), nereproducibilan je, pa iako je brz i jednostavan ne preporučuje se za procenu efekta antitrombocitnih lekova.

Određivanje efikasnosti primene antitrombocitnih lekova može se vršiti i primenom protočne citometrije, određivanjem serumskog tromboksana B2, stabilnog metabolita TxA2, kao i određivanjem koncentracije 11-dehidrotromboksana B2 u mokraći, koji je metabolit stabilnog tromboksana B2. Ove metode još uvek imaju veći naučno-istraživački nego klinički značaj.

 

Vođenje antitrombocitne terapije i pojava rezistencije

 

Mogućnost praćenja trombocitnog odgovora na terapiju aspirinom i klopidogrelom može imati veliki uticaj na vođenje terapije i značajno smanjenje stope morbiditeta i mortaliteta.  Osnovne dileme na koje ispitivanje funkcije trombocita treba da da odgovore su: da li je izabrana prava terapija i u pravoj dozi, da li i kada treba isključiti lekove i kako postupati u slučajevima kada je pacijent vitalno ugrožen, ukoliko treba da se podvrgne hirurškoj intervenciji, a uzima antitrombocitne lekove? Prekid antitrombocitne terapije pre hirurške intervencije je jedno od najkontroverzijnih pitanja danas, obzirom da su mišljenja oprečna, a tabela 3 prikazuje preporuke Nemačkog Udruženja Anesteziologa koje su uglavnom opšte prihvaćene i na našim prostorima.

Tabela 3. Vođenje antitrombocitne terapije u sklopu hirurške intervencije (isključiti u periodu pre intervencije – uključiti u periodu posle intervencije)

 

Važno je napomenuti i da funkciju trombocita treba ispitivati u slučajevima kada su pacijenti primali transfuzije koncentrata trombocita i dezmopresin (DDAVP).

Jedan od važnih ciljeva praćenja anti-trombocitne terapije je izdvojiti pacijente koji ne dobijaju potrebnu zaštitu sa antitrombocitnom terapijom, ali i utvrditi moguće uzroke neuspeha terapije, čija se stopa sa godinama povećava. Termin trombocitne rezistencije podrazumeva suboptimalni odgovor na primenu antitrombocitnog leka i ne sme olako upotrebljavati, jer može imati štetan efekat ako se ne protumači ispravno. Pogrešno identifikovan, može proizvesti povećani rizik tromboze, ako se terapija pogrešno prekine, ili povećani rizik hemoragije, ako se doza antitrombocitnog leka pogrešno poveća. Definicija aspirinske rezistencije je u literaturi vrlo raznovrsna i opisuje se kao neuspeh u prevenciji trombotičnog događaja, nesposobnost aspirina da inhibiše stvaranja tromboksana (TxA2) ili da izazove produženje vremena krvarenja. Takođe, izostanak svakog efekta in vivo testiranja aktivnosti trombocita može se definisati kao aspirinska rezistencija, a razlozi njenog nastanka nalaze se u individualnom oporavku trombocita nakon primene aspirina, trombocitnoj hiperreaktivnosti, molekularnim genetskim varijantama COX-1 i interreakciji drugih lekova sa COX-1 inhibitorima. S druge strane, rezistencija na klopidogrel je posledica varijabilnosti trombocitnog odgovora na ADP, genetske varijabilnosti (polimorfizam enzima jetre koji su uključeni u metabolizam klopidogrela ili u okviru P2Y12 trombocitnog receptora) ili intereakcije sa lekovima (npr. inhibitori protonske pumpe).

 Potencijalna veza između raznolikosti efekta antitrombocitne terapije i kliničkog ishoda još uvek nije potpuno razjašnjena, najviše zbog činjenice da još uvek nije opšte prihvaćena potpuna definicija rezistencije. Dosadašnja ispitivanja su pokazala da je odgovor na klopidogrel udružen sa kardiovaskularnim ishodom nakon implantacije koronarnog stenta, kao i da je stepen agregacije trombocita neposredno pre ugradnje stenta kod pacijenata koji su primili visoke doze klopidogrela u direktnoj korelaciji sa ishodom procedure. Buonamici P i saradnici su pokazali da je loš odgovor na primenu klopidogrela značajan samostalni prognostički činilac tromboze stenta kod pacijenata kojima je ugrađen stent sa sirolimusom ili paclitaxelom. Jasno je da ukoliko testiranje inhibicije agregacije trombocita pokaže nedovoljnu efikasnost antitrombocitnog leka, preporučuje se povećanje doze leka i ponovno testiranje u određenom vremenskom periodu.

Efikasnost različitih metoda određivanja odgovora trombocita na primenu antitrombocitnih lekova analizirana je u sklopu brojnih savremenih ispitivanja. Tantry US  i saradnici su pokazali dobru korelaciju u otkrivanju rezistencije na aspirin između klasične agregometrije i modifikovane tromboelastografije, Sibbing D i saradnici su pokazali značajnu korelaciju između ADP-indukovane agregacije trombocita primenom PFA-100 i Multiplate analyzer-a kod pacijenata na programu koronarne angiografije koji su primali 600 mg klopidogrela u pojedinačnoj dozi (koeficijent korelacije 0,73), dok Seyfert UT u svom ispitivanju zdravih dobrovoljaca i davaoca krvi koji nisu koristili antitrombocitne lekove nije pronašao korelaciju između pomenute dve metode. Naše ispitivanje (Antić A i saradnici, 2011.) je pokazalo da je Multiplate analyzer daleko osetljiviji na istovremenu primenu aspirina i klopidogrela (p<0,05 za aspirin, p<0,001 za klopidogrel) i samo klopidogrela (p<0,001), dok nema statistički značajne razlike u osetljivosti testiranja kod pacijenata koji koriste samo aspirin. Uvođenje PFA-Innovance P2Y12 značajno povećava osetljivost na primenu klopidogrela, te je smanjilo razliku između osetljivosti testiranja u toj grupi pacijenata. Martin-Toutain I i Collet J su u svom ispitivanju dobili komparabilne rezultate, a Paniccia R je pokazala da je mogućnost greške testiranja na Multiplate analyzer-u manja od 5 % kod kontrolnih subjekata i 7 % kod pacijenata na antitrombocitnoj terapiji. Podaci u savremenoj literaturi o prevalenci rezistencije na aspirin su prilično nekonzistentni i variraju od 5 % do 80 %, zavisno od primenjene dijagnostičke metode. Iako je taj raspon širok, postoje uverljivi dokazi da je rezistencija na antitrombocitne lekove klinički visoko značajna, jer je udružena sa kardiovaskularnim, cerebrovaskularnim ili perifernim arterijskim oboljenjima. U svakom slučaju postoji korelacija između rezultata testiranja agregacije trombocita na svetlosnom i impedantnom agregometru, s tim što se impedantna agregometrija potvrđuje kao superiorna metoda, obzirom na veću osetljivost i brzinu testiranja, kao i uključivanje u transfuzijske algoritme na kojima se bazira primena produkata krvi. Kliničke studije u budućnosti treba usmeriti u pravcu koji bi pokazao koji parametar funkcije trombocita najbolje korelira sa povećanim rizikom za tromboembolizam kod pacijenata kod kojih je pokazan smanjen odgovor antitrombocitne terapije.

 

 

 

Literatura neophodna za pripremu kandidata za rešavanje testa

 

ü  Antić A, Stanojković Z, Stanojević G, Mačukanović-Golubović L. Laboratorijsko praćenje efekta primene aspirina i klopidogrela. Bilt Transfuziol 2011; 57(1-2): 64-9.

 

ü  Guyer KE. The present state of aspirin and clopidogrel resistance. Hämostaseologie 2009; 29: 285–90.

 

ü  Protasiewicz M, Szymkiewicz P, Kuliczkowski W, Mysiak A, Witkiewicz W. Modern Antiplatelet Therapy - Opportunities and Risks. Adv Clin Exp Med 2013; 22(6): 875-85.

 

ü  Paniccia R, Priora R, Liotta AA, Maggini N, Abbate R. Assesssment of platelet function: laboratory and point-of-cate methods. World J Transl Med 2014; 3(2): 69-83.

 

ü  Kovács EG, Katona E, Bereczky Z, Homoródi N, Balogh L, Tóth E, Péterfy H, et al. Evaluation of laboratory methods routinely used to detect the effect of aspirin against new reference methods. Thromb Res 2014; 133: 811-6.

 

 

www. uzrnis. rs